Estudio de la expresión del receptor LAIR-1 en macrófagos humanos. Posible implicación en el desarrollo de cirrosis hepática

TEMA	ESTUDIO DE LA EXPRESIÓN DEL RECEPTOR LAIR- 1  EN  MACRÓFAGOS  HUMANOS.  POSIBLE  IMPLICACIÓN  EN  EL  DESARROLLO  DE  CIRROSIS HEPÁTICA.
OBJETIVOS	Estudiar la expresión del gen LAIR-1 mediante qRT-PCR en macrófagos peritoneales  obtenidos  del  líquido  ascítico  de  pacientes  con  cirrosis  hepática,  y  su  comparación  con  los  obtenidos  para  macrófagos  de  sangre  periférica  de  donantes  sanos,  como  población  de  referencia.
MUESTRA	Macrófagos peritoneales  obtenidos  del  líquido  ascítico en paciente con cirrosis hepática. Macrófagos  de  sangre  periférica  de  donantes  sanos. (ARN)
EXAMEN	MACRÓFAGOS PERITONEALES  OBTENIDOS  DEL  LÍQUIDO  ASCÍTICO:  LISIS: Física centrifugación del LA a 1500 rpm. SEPARACIÓN: Las células  obtenidas  del  LA  fueron  lavadas  en  tampón  fosfato  salino  (PBS)  y resuspendidas en DMEM +glutaMAX (GIBCO Invitrogen, Paisley, UK) suplementado con un 10%  de suero de ternera fetal (STF) previamente descomplementado por calentamiento a 56º C durante 30 minutos y con 50 U/ml de penicilina y 50 g/ml de estreptomicina. PURIFICACIÓN: Tras  incubación  durante  la  noche  a  37ºC,  las  células  fueron lavadas  con  MCC  para  eliminar  aquellas  células  no  adherentes,  quedándonos  así  sólo  con  la fracción de macrófagos que han quedado adheridos al fondo del pocillo. La pureza de M-DM en los cultivos celulares fue mayor al 95%. MACRÓFAGOS  DE  SANGRE  PERIFÉRICA : Estas muestras fueron donadas previo descarte por el Centro al no alcanzar el peso óptimo necesario para su uso, y su extracción no se realizó en ningún caso para obtener muestras de estudio. SEPARACIÓN: Ésta  se  realizó  mediante  centrifugación  a temperatura  ambiente  a  2000  rpm  durante  20  minutos  sin  freno. PURIFICACIÓN: Tras incubación durante 24h, las células fueron lavadas con MCC como en el apartado anterior.
GEN AMPLIFICADO	LAIR-Fa (forward)      104pb LAIR-R (reverse)        104pb LAIR-Fb (forward)    54pb LAIR-R (reverse)       54pb GAPDH-F (forward)     100pb GAPDH-R (reverse)     100pb
PCR	TIPO: Qrt-PCR              ºC        T                   # D         95        15seg H         60        1min        ] 40 ciclos E          95         15 seg
VISUALIZACIÓN	Se visualizaron tras tinción con bromuro de etidio en un transiluminador de luz ultravioleta. EFO

Bibliografía

PRUEBA CONFIRMATORIA

PRUEBA DE TAMIZAJE Y CONFIRMATORIAS

TAMIZAJE

Las herramientas de tamizaje nos dan porcentajes de riesgo de desnutrición La desnutrición es una complicación frecuente en los pacientes con cirrosis hepática. Los hombres presentan mayor afección en la reserva muscular y las mujeres en la reserva de tejido adiposo corporal. Es recomendable emplear herramientas con indicadores de composición corporal como el Royal Free Hospital Global Assessment. mediante esto podemos encontrar la enzima Gamma-glutamil transpeptidasa elevada en pacientes con cirrosis, 

Mediante otros estudios de tamizaje podemos determinar anticuerpo antimitocondrial en pacientes con cirrosis biliar primaria. Otra proteina alterada en la cirrosis y que nos sirve para estudios el la alfa 1 fetoproteina (AFP)

PRUEBAS CONFIRMATORIA

Endoscopia

Permite diagnosticar las lesiones de la mucosa.

Biopsia
Es la prueba más usada para confirmación de cirrosis hepática, un examen en donde se toma una muestra de tejido de este órgano para su análisis.

Bibliografía 1

Bibliografía 2

Bibliografia 3

ALTERACIONES EN LA TRADUCCIÓN

La traducción es un proceso en el cual la información del ARN-m se transforma a proteínas, está basado en la "leída" del ARNm que fue producido por medio del proceso de la transcripción. Cualquier cambio en el ADN que codifica un gen producirá una alteración del ARNm que es producido. Desde luego, el ARNm alterado puede conllevar a la producción de una proteína que ya no funciona como debe ser. El cambio de un solo nucleótido en el ADN de un gen puede producir una proteína que no funciona para nada.

En el hígado las células estelares se encuentran en el espacio de Disse y contienen gran cantidad de vitamina A, debido al daño hepático estas células proliferan inducidas por la secreción autocrina y paracrina de citocinas tales como: el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y el factor de crecimiento transformante β tipo 1 (TGF-β1); pierden su capacidad de almacenamiento de vitamina A; esto acasiona una transformación fenotípica a miofibroblastos , los cuales producen una gran cantidad de proteínas colagenosas y no colagenosas , acumulo de laminina α-1, tenascina y fibronectina. El hígado cirrótico tiene seis veces mas proteínas en la matriz extracelular que el hígado normal.

En el daño temprano se acumulan: fibronectina, colágenas tipo III y V; mientras que en el daño crónico hay incremento de colágenas I y IV, undulina, elastina y laminina.

Con el daño progresivo estas proteínas interaccionan con las estructuras vasculares, produciendo una estructura anormal en forma de nódulos (característico de la cirrosis)

Las MMPs (metaloproteinas de la matriz) son las causantes del aumento de tejido fibrótico.

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Bibliografía 2

ALTERACIONES EN LA TRANSCRIPCIÓN 

El proteasoma es un complejo proteico grande presente en todas las células eucariotas. Los proteasoma 20S núcleo catalítico se une a diferentes activadores (19S, 11S y PA200), para realizar funciones específicas, tales como la transcripción.

La vía de la ubiquitina-proteasoma es una de las vías vitales en la célula que se vuelve disfuncional como resultado del consumo de alcohol. La inhibición de la actividad del proteasoma en el núcleo provoca cambios en los factores de transcripción, modificación en las enzimas de las histonas, y por lo tanto, afecta los mecanismos epigenéticos.

Recientemente, la actividad del proteasoma se ha medido en los núcleos aislados a partir de células del hígado de ratas alimentadas con etanol crónicamente, y el proteasoma se encontró que se inhibió significativamente. Por tanto, la inhibición de la actividad del proteasoma en el núcleo está implicado etiológicamente en la acumulación de proteínas dañadas en el núcleo, y en la desregulación de la transcripción.

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ALTERACIONES EPIGENÓMICAS EN CIRROSIS HEPÁTICA

La ingestión de alcohol causa alteración en varios mecanismos celulares, y conduce a la inflamación, apoptosis, defectos inmunológicos, y fibrosis. Estos fenómenos están asociados con cambios significativos en los mecanismos epigenéticos y, posteriormente, a la memoria de células del hígado.

El consumo de alcohol se ha asociado con un aumento de la acetilación de histonas y una disminución en la metilación estas, lo que conduce a los cambios de expresión génica. El ADN y las histonas modifidas que resultan de la inhibición del proteasoma inducida por el etanol son actores clave en la regulación de la expresión de genes, especialmente genes implicados en el ciclo celular, las respuestas inmunológicas, y el metabolismo de etanol.

En el ADN combinado se identificó 230 genes, cuyos promotores fueron hipometilados y tienen una elevada expresión de HCC, y 322 genes que fueron hipermetilados pero con baja expresión de tumores.

La hipermetilación afecta a islas CpG localizadas en las regiones promotoras y a intrones
reguladores, particularmente, en genes supresores de tumores como p16INK4a, IGFR-II/MP6, BRCA1 y E-cadherina.

Los virus pueden ser un factor importante para que exista una relación entre epigenética y tumores. La proteína oncogégina HBX de HBV induce a la expresión de DNMT1, 3a y 3b para la simulación de una hipermetilación de IGFBP y p16 INK y con ésto producir también una hipometilación.

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Bibliografía 2
Bibliografía 3
Bib